Column chromatography
1. 개요
고정상을 긴 원통형의 칼럼에 채운 뒤 그 속에 시료 용액을 넣어 출구로 용액을 흘러내리게 하여 목적 성분을 분석하는 크로마토그래피.관크로마토그래피, 칼럼 크로마토그래피, 컬럼 크로마토그래피 등으로 불린다. 대한화학회의 화학술어집에서는 '관크로마토그래피'로, 표준국어대사전에서는 '관 크로마토그래피' 및 '칼럼크로마토그래피법'으로 등재되어 있다.
여러 종류의 크로마토그래피 중 가장 처음 사용된 크로마토그래피이다. 첫 크로마토그래피에서는 고정상으로 탄산마그네슘을 사용했다.
2. 특징
거의 대부분의 혼합물을 분리할 수 있기 때문에 유기화학 실험이나 생화학 실험에서 애용되는 기술이다. 분리된 물질을 비교적 다량으로 분리하여 얻을 수 있다. 유기화학 실험실의 경우 많은 시간을 컬럼 크로마토그래피로 혼합물을 분리하는데 보내게된다.그러나 굉장히 피곤한 것이, 언제 어느 구간에서 원하는 화합물이 나오리라는 보장이 없다. 그렇기 때문에 자리를 비우지 못하고 계속해서 TLC로 물질의 여부를 확인해줘야하며, 식사시간이 겹친다고 해서 콕을 잠가둘 수도 없다. 콕을 잠그면 컬럼 내부에서 혼합물들이 확산되어 band broadening이 일어나며, 농도도 옅어지고 목표 화합물이 다른 화합물과 영역이 겹쳐 분리가 되지 않는 일이 벌어진다.
이렇게 시간이 오래걸리고 고된 방법인지라 자동으로 분리해주는 기계가 나와있긴하다. UV 검출기로 용질이 나오고 있다는 것을 알려주기도 하고, 자동으로 용출액을 받을 바이알도 교체해주기 때문에 편하지만, 전개용매에 대한 기질의 용해도가 떨어지면 컬럼 중간에 석출되는 사고가 벌어지면 분리가 힘들어지기 때문에 여전히 수동으로 하는 것을 더 선호한다.
3. 원리 및 방법
3.1. 칼럼
유리나 플라스틱제 등으로 이루어진 관 하단에 코크를 부착한 크로마토 칼럼을 사용한다. 분리하려는 혼합물의 양이 많으면 많을수록 컬럼의 두께가 두꺼워야한다. 그렇다고 너무 두꺼운 컬럼을 사용하면 낮은 농도로 나오기 때문에 TLC로 확인이 어려울 수 있다.컬럼의 콕은 구멍이 크게 뚫려있는 것이기 때문에 여기에 그대로 실리카를 부어버리면 그대로 아래로 쏟아진다. 그렇기 때문에 컬럼의 맨 아래부분을 솜으로 틀어막아야한다. 그렇다고 솜을 너무 많이 넣으면 이동상인 용매가 거의 나오지 않는
칼럼에 고체 정지상 입자들을 채워서 사용하는 충전 칼럼(packed column)과 칼럼의 내벽에 액체 정지상(또는 고체 정지상)이 코팅되어 칼럼의 중심부가 비어 있는 열린 관칼럼(open tubular column)이 있는데, 현대에는 고분리도, 짧은 분석 시간, 높은 감도 및 적은 양의 시료 사용 등의 장점으로 인하여 주로 열린 관 칼럼을 사용한다. 패킹이 얼마나 균일한가에 따라 분리 효율에 차이가 생긴다.
유기 합성을 주로 하는 실험실에서는 가끔 높이가 1m가 훨씬 넘는 크고 아름다운 칼럼도 볼 수 있다. 한 번 할 때마다 평균 5% 내외의 손실이 발생하며, 숙련된 사람은 더 줄일 수도 있다. 이동상, 고정상과의 친화도에 따라 결과가 발생한다.
3.2. 고정상과 이동상
고정상은 실리카(SiO2, 이산화 규소)[1]나 알루미나(Al2O3, 산화 알루미늄)을 주로 사용한다. 고정상의 입자형태, 입도 분포 역시 전개율에 영향을 미친다.이동상으로 쓰이는 용매는 액체이며, 실험에 따라 쓰이는 용매가 다양하지만, 보통은 헥세인과 에틸 아세테이트 혼합물을 사용한다. 극성이 매우 커서 에틸 아세테이트만으로도 전개가 되지 않을 경우엔, 메틸렌 클로라이드에 소량의 메탄올을 섞어서 사용한다. 메탄올만 단독으로 사용하면 혼합물이 전부 메탄올에 끌려 나와버리는데다가 실리카를 녹여내서 칼럼이 투명해지므로 사용이 권장되지 않는다. 그래도 전개가 되지 않을 경우엔 역상 크로마토그래피를 진행하는 것이 속편할 것이다(...).
3.3. 방법
소량의 용매로 녹인 시료액을 칼럼에 넣으면 가장 강하게 흡착되는 성분은 칼럼의 꼭대기 근처에 머무르게 되고 다른 성분은 흡착제에 대한 친화성에 따라서 칼럼의 아래로 점점 이동하면서 착색대를 형성한다. 하단의 코크부분에서 유출한 유출액에 대해서 성분분석을 한다. 현대에는 자동분석기가 분석 수단으로 함께 쓰이고 있다.관크로마토그래피를 사용하기 전에 혼합물을 TLC로 전개하여 용매에서 분리하고자 하는 물질의 전개율(Rf)을 확인해야 한다. 0.3 ~ 0.4 정도가 되어야 분리가 쉽게 되는 편이다. 이후 전개용매를 설정한 뒤, 칼럼을 만들어서 칼럼이 시료 용액을 흐르게 하여 층상 구조를 만든다. 적당한 용매를 흐르게 하여 층상의 각 성분을 완전히 분리시키고, 경우에 따라 발색시약을 사용하여 순차적으로 흘러나오는 각 성분을 나누어 크로마토그래피를 얻는다.
3.3.1. Wet packing
Wet packing은 실리카를 용매와 섞은 뒤 컬럼에 부어서 패킹을 하는 방식이다. 가장 기본적이고, 패킹도 잘 되는 편이다. 그러나 원래 실리카는 극성이 큰 용매가 아니면 녹지 않는 가루로 떠다니는데다, 거의 겔처럼 되어있다. 그 혼합물을 재주껏(...) 컬럼에다 부어넣어야하는데 컬럼이고 바닥이고 비커고 실리카가 떨어지지않고 붙어있게 되어서 굉장히 지저분해진다. 그래도 packing이 공기방울의 방해를 받거나 하는 일이 적은 편이기에 쉽게된다.3.3.2. Dry packing
Wet과는 반대로 실리카를 마른 상태 그대로 컬럼에 넣어버리기 때문에 dry packing이라고 부른다. 그 후 용매를 실리카 위에다 그대로 부어버리고, 압축공기로 밀어내는 방식으로 packing을 한다. Wet 방식처럼 컬럼에 실리카를 채우는 과정이 수고스럽지도 않고, 실리카를 담아둔 비커에 말라붙은 실리카도 없기에 깨끗하고 쉽게 할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 문제는 packing 도중에 공기방울의 방해를 받을 가능성이 매우, 반드시에 가까울 정도다. 그래서 wet에 비해 packing 시간이 오래 걸리나 간편하기 때문에 선호되기도 한다.3.3.3. Loading
Packing이 끝난 실리카 컬럼에 혼합물을 흡착시키는 과정을 loading이라고 한다. Loading을 할 때 주의해야하는데, loading 해준 두께가 너무 두꺼우면 섞이는 구간이 많이 생기게 되며, 편평하지 않고 휘어있으면 휜 모양 그대로 샘플이 내려오는 대참사가 벌어진다.혼합물을 최소한의 용매로 녹여서 액상으로 만들어서 loading을 하는 것이 최선의 방법이다. 전개용매가 혼합물을 매우 잘 녹여 10 방울 내외의 용매로 전부 녹일 수 있다면 최고의 조건이라고 할 수 있다. 그렇게 녹여낸 용액을 벽을 따라, 실리카 컬럼의 맨 위에 조금씩 떨어지게 해주면된다.
만약 혼합물이 전개용매로 녹지 않는다면, 극성이 높은 용매를 약간만 사용해도 괜찮다. 메틸렌 클로라이드와 같은 용매는 극성을 크게 증가시키지 않으면서 많은 용매를 녹여낼 수 있기 때문에 소량씩 사용되기도 한다. 그러나 그런 경우에도 녹지 않는
처음부터 샘플을 실리카에 흡착시켜서 loading하는 방법인데, 여러가지로 귀찮은 상황이 발생할 수 있기에 가능하면 혼합물을 녹일 수 있는 용액을 찾는게 좋다. 있더라도 용액의 극성이 지나치게 크다면 dry loading을 하는 것이 낫다.
혼합물을 조금이라도 많이 녹이되, 감압증류로 쉽게 제거할 수 있는 용매로 혼합물을 녹인다. 그 후 그 용액에 실리카를 적당량 넣고 섞어주고, 감압증류로 용매를 제거해준다. 성공적으로 했다면 실리카가 모래처럼 바짝 말라 흘러다닐것이다. 만약 그렇지 않고 끈적이거나, 마른 상태가 아닌 상태라면 실리카가 모자라므로 조금 더 넣어서 다시 감압증류를 하면 된다.[3][4] 이후 샘플이 흡착된 실리카를 컬럼 위에 그대로 부어버리고 전개용매를 약간 넣어 그 부분도 packing이 될 수 있게 한다. 그 뒤는 똑같이 seasand를 넣고 전개용매를 넣어 크로마토그래피를 진행하면 된다.
4. 종류
관크로마토그래피 형태를 사용하는 크로마토그래피의 종류. 각 크로마토그래피에 대한 설명은 각 크로마토그래피 문서의 종류 문단에서 설명한다.- 흡착 크로마토그래피: 고정상으로 실리카, 규산, 알루미나, 활성탄, 산화마그네슘을 사용한다.
- 분배 크로마토그래피: 고정상으로 녹말, 셀룰로스를 사용한다.
- 이온 교환 크로마토그래피: 고정상으로 이온 교환 수지를 사용한다.
- 순상 크로마토그래피
- 역상 크로마토그래피
- 크기배제 크로마토그래피
5. 출처
- 두산백과 - 칼럼크로마토그래피
- 화학대사전 - 컬럼 크로마토그래피
- 간호학대사전 - 칼럼크로마토그래피
- 영양학사전 - 칼럼크로마토그래피
- 화학용어사전 - 칼럼크로마토그래피
- 농업용어사전: 농촌진흥청 - 칼럼크로마토그래피
- 이우주 의학사전 - column chromatography
- 식품과학사전 - 칼럼크로마토그래피
- 사이언스올 과학백과사전 - 칼럼크로마토그래피(column chromatography)
- 생화학백과 - 관 크로마토그래피
- 생명과학대사전 - 관크로마토그래피
[1]
실리카는 폐암을 일으킬 수 있는 등 폐 건강에 매우 좋지 않으므로, 다룰 때는 가동 중인 후드에서 마스크를 쓰고 다뤄야 안전하다.
[2]
그냥 모래가 아닌, 굵기들이 거의 일정한 알갱이를 모아둔 것을 따로 판매한다.
[3]
만약 감압증류 도중에 용액이 끓어 넘친다면 트랩이고 로터리고 실리카로 전부 오염되어 분해 청소를 해야하는 지옥도가 벌어지므로 범핑을 하지 않도록 신경써줘야한다.
[4]
감압증류가 끝나도 플라스크 벽면에 실리카가 붙어서 안떨어지는데, 전부 스패츌라로 긁어서 떨어뜨리도록 해야한다.